产品货号:
RFT219
中文名称:
Native-PAGE胶制备试剂盒
英文名称:
Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水。本试剂盒可用于配制非变性PAGE凝胶,可配制30-50块常规大小的非变性PAGE胶。
由于本系统采用非连续Laemmli凝胶系统,分离胶pH为8.8,因此要求待分离的蛋白等电点pI≤7.0,这样蛋白在凝胶系统内带负电荷,在凝胶电泳中才能正常向正极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI>7.0,请选择碱性电泳凝胶系统分离(货号RFT220)。
保存:按标签指示条件保存,有效期1年。
一、准备工作
APS溶液配制:
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
二、制胶
三、电泳
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由于本系统采用非连续Laemmli凝胶系统,分离胶pH为8.8,因此要求待分离的蛋白等电点pI≤7.0,这样蛋白在凝胶系统内带负电荷,在凝胶电泳中才能正常向正极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI>7.0,请选择碱性电泳凝胶系统分离(货号RFT220)。
组分 | 规格 | 保存条件 |
30% PAA(29:1) | 100mL | 4℃ |
4×分离胶缓冲液,pH8.8 | 100mL | |
4×浓缩胶缓冲液,pH6.8 | 50mL | |
TEMED | 0.5mL | 4℃,避光 |
5×非变性非还原蛋白上样缓冲液 | 1mL | -20℃ |
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(干粉) | 1L | RT |
APS(干粉) | 0.5g |
保存:按标签指示条件保存,有效期1年。
一、准备工作
APS溶液配制:
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中,彻底溶解后分装,1mL/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
二、制胶
- 制备分离胶
- 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
- 按照表一将不同体积的分离胶成分在小烧杯中混匀;最后加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀。
表一:配制不同浓度凝胶所需各组分的体积成分 浓缩胶 分离胶 5% 6% 8% 10% 12% 15% 超纯水(mL) 1.15 2.7 2.4 2.0 1.7 1.2 30% PAA(29:1)(mL) 0.33 1 1.3 1.7 2 2.5 4×浓缩胶缓冲液(mL) 0.5 - - - - - 4×分离胶缓冲液(mL) - 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 10% APS(μL) 20 50 50 50 50 50 TEMED(μL) 2 5 5 5 5 5 总体积(mL) 2 5 5 5 5 5 - 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于8×10cm凝胶,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1cm的水层,使凝胶表面保持平整。
- 静置10~20分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合。
注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
- 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
- 制备浓缩胶
- 去除覆盖在分离胶上的水层。
- 按照表一将不同成分在一个小烧杯或试管中混合;最后加入10% APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀。
- 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
- 将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
- 静置30~60分钟,等待浓缩胶聚合。
注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
- 去除覆盖在分离胶上的水层。
三、电泳
- 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(不含SDS)的配制
将一包5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中,加入约900mL水彻底溶解,用水定容至1L,即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(此溶液不用调节pH值)。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 - 样品处理:融化-混合-上样
- 将5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温融化后混匀。
- 将上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀。
- 快甩离心收集到管底,上样电泳。(不要加热处理样品)
- 将5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温融化后混匀。
- 电泳
在电泳槽的内槽加入1×电泳缓冲液,轻轻拨出梳子,冲洗加样孔,随后在电泳槽外槽加入适量的1×电泳缓冲液。上样,恒电压150V电泳。恒电压 150V 起始电流 30~40mA 终止电流 10~20mA 电泳时间 40~50min - 染色或进行下游实验
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