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本试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水。本试剂盒可用于配制非变性PAGE凝胶，可配制30-50块常规大小的非变性PAGE胶。


由于本系统采用非连续Laemmli凝胶系统，分离胶pH为8.8，因此要求待分离的蛋白等电点pI≤7.0，这样蛋白在凝胶系统内带负电荷，在凝胶电泳中才能正常向正极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI＞7.0，请选择碱性电泳凝胶系统分离（货号RFT220）。

组分	规格	保存条件
30% PAA(29:1)	100mL	4℃
4×分离胶缓冲液，pH8.8	100mL
4×浓缩胶缓冲液，pH6.8	50mL
TEMED	0.5mL	4℃，避光
5×非变性非还原蛋白上样缓冲液	1mL	-20℃
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（干粉）	1L	RT
APS（干粉）	0.5g

保存：按标签指示条件保存，有效期1年。


一、准备工作
APS溶液配制：
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中，彻底溶解后分装，1mL/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

二、制胶

• 制备分离胶
  
  • 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
    
  • 按照表一将不同体积的分离胶成分在小烧杯中混匀；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀。
    表一：配制不同浓度凝胶所需各组分的体积
    

    成分	浓缩胶	分离胶
    	5%	6%	8%	10%	12%	15%
    超纯水(mL)	1.15	2.7	2.4	2.0	1.7	1.2
    30% PAA(29:1)(mL)	0.33	1	1.3	1.7	2	2.5
    4×浓缩胶缓冲液(mL)	0.5	-	-	-	-	-
    4×分离胶缓冲液(mL)	-	1.25	1.25	1.25	1.25	1.25
    10% APS(μL)	20	50	50	50	50	50
    TEMED(μL)	2	5	5	5	5	5
    总体积(mL)	2	5	5	5	5	5

    
    
  • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于8×10cm凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1cm的水层，使凝胶表面保持平整。
    
  • 静置10～20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
    注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
• 制备浓缩胶
  
  • 去除覆盖在分离胶上的水层。
    
  • 按照表一将不同成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10% APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀。
    
  • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
    
  • 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
    
  • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
    注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

三、电泳

• 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（不含SDS）的配制
  将一包5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900mL水彻底溶解，用水定容至1L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
  
• 样品处理：融化－混合－上样
  
  • 将5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温融化后混匀。
    
  • 将上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀。
    
  • 快甩离心收集到管底，上样电泳。（不要加热处理样品）
• 电泳
  在电泳槽的内槽加入1×电泳缓冲液，轻轻拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×电泳缓冲液。上样，恒电压150V电泳。
  

  恒电压	150V
  起始电流	30～40mA
  终止电流	10～20mA
  电泳时间	40～50min

• 染色或进行下游实验

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